在(-)-11-nor-9-羧基-△9-四氫大麻酚代謝物(THCCOOH)的氣相色譜-質(zhì)譜分析中,評估了EmporeTM固相萃取柱(4215SD-C18)的樣品制備。固相萃取柱性能由測定的回收率決定?;厥章史秶?/span>78.7-110.1%。標(biāo)準曲線線性范圍在0.15μg/mL~3.0μg/mL時,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。
關(guān)鍵詞:
四氫大麻酚,THCCOOH,外標(biāo)法,GC-MS
前言:
美國CDS公司膜式固相萃取 (SPE)技術(shù),以其有機溶劑消耗少、結(jié)果重現(xiàn)性高、樣品制備的通量高、提取物更清潔,可減少 GC 系統(tǒng)的污染以及自動化提取等優(yōu)勢[1],廣泛應(yīng)用于藥物檢測領(lǐng)域[2,3]。本實驗使用美國CDS公司膜式固相萃取柱(EmporeTM,4215SD-C18)提取尿液中△9-四氫大麻酚(THC,大麻)代謝物(-)11-nor-9-羧基-△9-四氫大麻酚 (THCCOOH),并以GC-MS分析定量。
1, 實驗過程
所有試劑均為分析純或更高。
THCCOOH(100.0±0.6 μg/mL)和 MSTFA + 1% TMCS硅烷化試劑,均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;
人工尿液(PH:5.7-500mL),購自福州飛凈生物科技有限公司;
乙酸乙酯(色譜純),購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;
甲醇(色譜純),購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;
正己烷(色譜純),購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;
EmporeTM 膜式固相萃取柱:4215SD-C18,購自美國CDS公司;
氣質(zhì)聯(lián)用儀:7890B-5977B安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀,Agilent公司。
THCCOOH標(biāo)準使用溶液:0.1 μg/mL,溶劑體系為甲醇;
1.3 實驗部分
取12個15mL離心管,分別裝入3mL尿液樣品,再加入不同體積的THCCOOH標(biāo)準使用液(加標(biāo)量分別為3ng、15ng、30ng、60ng、150ng、300ng),每個標(biāo)點進行平行兩次制備。然后加入300μL氫氧化鉀溶液(10mol/L),在60℃水浴環(huán)境下水解15min取出后冷卻至室溫,再以冰醋酸調(diào)節(jié)pH值到4.0~4.5。
EmporeTM固相萃取柱(C18, 7mm/3mL)預(yù)先用150μL甲醇進行活化,之后進行上樣(在重力作用下使樣品自然流下),上樣結(jié)束后用750μL甲醇-水溶液(50:50)淋洗萃取柱,在690mmHg真空狀態(tài)下干燥5min,最后用800μL正己烷-乙酸乙酯溶液(75:25)進行洗脫。
洗脫液經(jīng)40℃氮吹至干,然后加入100μL衍生試劑(MSTFA+1%TMCS),在60℃水浴條件下衍生20min,轉(zhuǎn)移至樣品瓶待 GC-MS分析。
取6個20mL樣品瓶,分別加入不同體積THCCOOH標(biāo)準使用溶液,加入THCCOOH的質(zhì)量分別為3ng、15ng、30ng、60ng、150ng、300ng,參照與加標(biāo)樣品制備同等濃縮、衍生條件進行前處理,待GC-MS分析。
進樣口溫度:290℃;進樣模式:不分流進樣;流速:1.0mL/min;
柱溫:100℃保持1min,然后以30℃/min的速度升至300℃,保持5min。
表1 THCCOOH定量、定性離子
化合物 | 定量、定性離子 | 保留時間(min) |
THCCOOH | 371/473/488 | 12.158 |
2, 實驗結(jié)果(外標(biāo)法)
實驗發(fā)現(xiàn):標(biāo)準曲線第一個點(3ng)信噪比較低,難以準確積分。標(biāo)準曲線第五個點(150ng)結(jié)果明顯偏低,為實驗操作衍生化失誤引進誤差。
圖1標(biāo)準曲線校準點重疊色譜圖
圖2 標(biāo)準曲線
3,結(jié)果與討論
本次實驗展示了一種使用CDS-EmporeTM 固相萃取柱(215SD-C18),對尿液中四氫大麻酚代謝物(THCCOOH)進行富集提取的簡單有效方法。實驗中,尿液加標(biāo)樣品經(jīng)水解、固相萃取凈化、濃縮以及衍生等前處理步驟后,經(jīng)GC-MS分析得到不同濃度下四氫大麻酚代謝物(THCCOOH)的加標(biāo)回收率,回收率范圍在78.7-110.1%,結(jié)果較好。標(biāo)準曲線濃度范圍在0.15μg/mL~3.0μg/mL時,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998,具有較好線性。實驗表明,CDS-EmporeTM 固相萃取柱(215SD-C18)適用于尿液中四氫大麻酚代謝物(THCCOOH)的萃取凈化。該方法具有操作簡便,線性范圍寬,穩(wěn)定性高等優(yōu)點,并在尿液量少,分析物濃度較低時顯示出優(yōu)異的回收率。
4,參考文獻
1,Jasbir Singh and Linda Johnson,Solid-Phase Extraction of THC Metabolite from Urine using the Empore Disk Cartridge Prior to Analysis by GC-MS,Journal of Analytical Toxicology, Vol. 21, September 1997。
2,R.H. Liu and B.A. Goldberger. Handbook of Workplace Drug Testing. AACC Press, Washington, DC, 1995.
3, A.H.B. Wu, N. Liu, Y.-J. Cho, K.G. Johnson, and S.S. Wong. Extraction and simultaneous elution and derivatiztion of 11-nor-9- carboxy-△9-tetrahydrocannabinol using Toxi-Lab SPEC prior to GC/MS analysis of urine, J. Anal. Toxicol. 17:215-17 (1993)
圖3 不同濃度加標(biāo)樣品重疊色譜圖
表2 加標(biāo)回收率結(jié)果
序號 | 加標(biāo)量 | 回收率 % | 均值 % | |
ng | 1 | 2 | ||
1 | 15 | 82.2 | 96.4 | 89.3 |
2 | 30 | 101.8 | 109.4 | 105.6 |
3 | 60 | 89.2 | 78.7 | 83.9 |
4 | 150 | 93.1 | 101.3 | 97.2 |
5 | 300 | 91.4 | 110.1 | 100.7 |
注:因3ng標(biāo)點信噪比偏低,在此不做數(shù)據(jù)統(tǒng)計